Hematologie



 


TESTE DE COAGULARE

Cuprind testele screening (PT, APTT), determinarea fibrinogenului, a timpului de trombina, determinarea factorilor coagularii si a inhibitorilor acestora, rezistenta la proteina C activata si determinarea anticoagulantilor lupici.

Timpul de protrombina PT
Este un test screening ce evalueaza activitatea factorilor implicati in calea extrinseca si comuna a coagularii (II, V, VII, X); prezinta sensibilitate scazuta pentru fibrinogen.

Metoda de determinare
Este o metoda coagulometrica prin care se masoara timpul de coagulare a plasmei sarace in trombocite in prezenta tromboplastinei calcice.
Rezultatele se exprima ca:

  1. - timp de coagulare (in secunde)
  2. - raport protrombinic intre PT-ul pacientului si cel al unei plasme normale
  3. - procent din activitatea normala (%)
  4. - INR (International Normalized Ratio)

Pentru mult timp, exprimarea rezultatelor exclusiv in secunde a intarziat procesul de standardizare a metodei. Standardizarea era necesara deoarece, in faza de stabilizare a tratamentului cu anticoagulante orale, rezultatele depind atat de sursa din care a fost extrasa tromboplastina, cat si de aparatura utilizata. Rezolvarea problemei a venit in 1983 cand Kirkwood si, mai apoi, Organizatia Mondiala a Sanatatii a introdus o procedura universala, standardizata, de validare a tromboplastinei. Conform acestei proceduri, fiecare lot de tromboplastina este caracterizat de un indice international de sensibilitate ISI (International Sensitivity Index). Cu cat ISI este mai mic, cu atat reactivul are o senibilitate mai mare.
Introducerea ISI a creat premisele convertirii raportului protrombinic in INR (International Normalized Ratio), parametru extrem de util in monitorizarea tratamentului cu anticoagulante orale si care nu depinde de reactivul folosit.
Exprimarea rezultatului sub forma de INR este recomandata numai la pacientii aflati sub tratament cu anticoagulante orale si nu are nicio valoare diagnostica.

Valoarea clinica a testului:

  1. screening-ul preoperator al bolilor hemoragice
  2. screening-ul deficientei de factori de coagulare implicati in calea extrinseca si comuna
  3. monitorizarea terapiei cu anticoagulante orale

Valori normale: >70%

1

Interval terapeutic
- INR 1.3 - 1.8 - preventia pacientilor cu risc crescut de infarct miocardic
- INR 2.0-3.0 - profilaxia si tratamentul trombozei venoase (in chirurgia ortopedica, ginecologica), tratamentul embolismului pulmonar, prevenirea emboliei sistemice la pacientii cu fibrilatie atriala, proteze valvulare cardiace, sindrom antifosfolipidic.
- INR 3.0-4.0 – infarct miocardic


Variatii patologice
Prelungirea PT poate fi intalnita in urmatoarele situatii:

  1. deficit de vitamina K si diateze hemoragice la nou nascuti
  2. deficit mostenit sau dobandit de factori II, V, VII, X
  3. afectiuni hepatice
  4. coagulare intravasculara diseminata
  5. hipo si disfibrinogenemie
  6. tulburari de absorbtie intestinala si malnutritie
  7. prezenta anticoagulantilor lupici
  8. tratament cu anticoagulante orale

 

Timpul de tromboplastina partial activata (APTT)
Este un test screening ce evalueaza factorii implicati in calea intrinseca si comuna a coagularii (II, V, VIII, IX, XI, XII); prezinta sensibilitate scazuta pentru fibrinogen.

Metoda de determinare
Este o metoda coagulometrica ce implica recalcifierea plasmei in prezenta unei cantitati standard de fosfolipide (cefalina) si a unui activator specific, diferit in functie de reactivul folosit (caolin, silica, polifenol).
Rezultatele se exprima in secunde.

Valoarea clinica a testului

  1. screening-ul preoperator al bolilor hemoragice
  2. screening-ul deficientei de factori de coagulare implicati in calea intrinseca si comuna (VIII, IX, XI, XII) si factorul von Willebrand
  3. monitorizarea tratamentului cu heparina (se foloseste in asociere cu anti Xa)

Valori normale: 26-40 s

Interval terapeutic in cursul terapiei cu heparina:1.5-2.5 ori valoarea nivelului de control

Variatii patologice
APTT prelungit se intalneste in urmatoarele situatii:

  1. deficit de vitamina K
  2. deficit mostenit sau dobandit de factori implicati in calea intrinseca ;hemofilie A si B, boala von Willebrand
  3. afectiuni hepatice
  4. coagulare intravasculara diseminata
  5. hipofibrinogenemie
  6. malnutritie
  7. tratament cu heparina nefractionata (UFH)
  8. tratament cu anticoagulante orale
  9. ratament cu inhibitori trombinici, streptokinaza, urokinaza
  10. prezenta anticoagulantilor lupici

Scurtarea APTT se intalneste in urmatoarele situatii:

  1. cresterea nivelului de factor VIII
  2. status post hemoragic acut
  3. coagulare intravasculara diseminata in stadiu precoce

2

 

 

Valorile APTT trebuie coroborate intotdeauna cu cele ale PT. Astfel, un APTT normal si PT prelungit poate indica un deficit de factori ai caii extrinseci (in special factor VII).
APTT prelungit si PT normal poate fi intalnit in deficitul de factori ai caii intriseci ( VIII, IX, XI sau XII) sau in cazul prezentei anticoagulantilor lupici
APTT, PT prelungite pot indica un deficit de factori I, II, V, X

 

Timpul de trombina
Evalueaza formarea fibrinei. Testul poate fi folosit si ca test screening impreuna cu PT si APTT pentru determinarea cauzei anomaliilor hemostatice in cazul unui PT sau APTT prelungit.

Valoarea clinica a testului

  1. investigarea cauzei APTT sau PT prelungit
  2. diagnosticul disfibrinogenemiilor, a hipo- si afibrinogenemiilor
  3. diagnosticul coagularii intravasculare diseminate
  4. monitorizarea tratamentului cu activatori ai plasminogenului

Valori normale: <21 s

Fibrinogenul
Fibrinogenul este o proteina esentiala in agregarea plachetara si coagularea sangelui.
Pentru determinare se foloseste metoda coagulometrica Clauss. Metoda utilizeaza plasma citratata saraca in trombocite, diluata 1:10 si aflata in prezenta unui exces de trombina. Timpul de coagulare al probei de analizat este invers proportional cu cantitatea de fibrinogen continuta. Metodele moderne utilizeaza reactiv de trombina ce contine inhibitori de heparina, astfel incat aceasta tehnica poate fi folosita si la pacientii aflati sub tratament cu heparina. Testul este unul functional, de activitate.
In cazuri speciale (disfibrinogenemii sau monitorizarea riscului cardiovascular), se recomanda teste antigenice (imunologice) ce determina cantitatea de fibrinogen fara evaluarea capacitatii functionale a acestuia.

Valoarea clinica a testului:

  1. screening preoperator
  2. diagnosticul defectelor calitative (disfibrinogenemii) sau cantitative dobandite sau mostenite (a- sau hipofibrinogenemii)
  3. monitorizarea tratamentului trombolitic
  4. evaluarea riscului de evenimente trombotice (infarct miocardic, accident vascular cerebral)

Valori normale: 200-400 mg/dl (variaza cu varsta).

Variatii patologice

  1. Cresteri: hipertensiune, diabet, obezitate, sindroame inflamatorii acute, boli hepatice, sindrom nefrotic, mielom multiplu
  2. Scaderi: afibrinogenemie si disfibrinogenemie congenitala, hipofibrinogenemie, tratament trombolitic, coagulare intravasculara diseminata, afectiuni hepatice severe

 

Determinarea factorilor coagularii
Determinarea individuala a factorilor coagularii constituie un test important pentru diagnosticul deficientei acestora.
Primul pas in protocolul de diagnostic il constituie efectuarea PT si APTT a caror prelungire poate sugera o deficienta a factorilor intrinseci (prelungirea APTT) sau extrinseci (prelungirea PT). Functie de calea afectata, se trece la determinarea individuala a factorilor coagularii specifice caii respective.
Determinarea factorilor implicati in calea extrinseca si comuna se face printr-o metoda coagulometrica ce consta in masurarea timpului de coagulare a probei de analizat in prezenta tromboplastinei calcice si a uni plasme ce contine in exces toti factorii coagularii mai putin factorul de testat.
Pentru factorii implicati in calea intrinseca si comuna se foloseste tot o metoda coagulometrica ce consta in masurarea timpului de coagulare a probei de investigat in prezenta cefalinei si a unui activator specific precum si a unei plasme ce contine in exces totii factorii coagularii mai putin cel analizat.

Valoarea clinica a testului
Factorii implicati in calea extrinseca si comuna:

  1. elucidarea cauzei alungirii PT
  2. diagnosticul deficientelor congenitale (foarte rare)
  3. diagnosticul defiecientelor dobandite (deficitul de vitamina K, afectiuni hepatice, coagulare intravasculara diseminata)

Factorii implicati in calea intrinseca si comuna

  1. elucidarea cauzei prelungirii APTT
  2. diagnosticul deficientelor congenitale
  3. diagnosticul deficientelor dobandite

Valori normale:
Factorii implicati in calea extrinseca

  1. Factor VII 55-170%
  2. Factor X 70-120%
  3. Factor V 70-120%
  4. Factor II 70-120%
  5.  

Factorii implicati in calea intrinseca

  1. Factor VIII 60-150%
  2. Factor IX 60-150%
  3. Factor IX 60-150%
  4. Factor XII 60-150%

 

Determinarea inhibitorilor coagularii
In mod curent, inhibitorii coagularii sunt evaluati prin doua tipuri de teste:

  1. teste functionale (de activitate) efectuate prin metode coagulometrice (clotting test)
  2. teste de antigenicitate (imunologice) efectuate prin metode ELISA, cromogenice, imunoturbidimetrice

Antitrombina
Antitrombina (AT) este un inhibitor important in cascada coagularii. In pofida numelui său, ce ar sugera o actiune exclusiva asupra trombinei, AT inhiba practic toti factorii coagularii, mai putin cofactorii. Principalii factori inhibati sunt factorul Xa si IIa. Heparina si heparansulfatul cresc de 1000 ori activitatea inhibitorie a AT.

Metode de determinare
Pentru determinarea AT se folosesc atat metode cromogenice (teste de activitate), cat si imunologice (teste de antigenicitate).
Cel mai des se utilizeaza metoda cromogenica (test de activitate) in doua etape:

  1. Plasma este incubata cu o solutie de trombina in exces, de concentratie cunoscuta.

AT + (heparina) + trombina AT-heparina-trombina +trombina reziduala

  1. Trombina reziduala este determinata prin reactia enzimei cu un substrat cromogen si citirea extinctiei compusului colorat obtinut la 405nm.

 

Cum cantitatea de trombina inhibata in prima etapa este direct proportionala cu cantitatea de AT prezenta in proba, cantitatea de trombina reziduala este invers proportionala cu concentratia de AT.

Valoarea clinica a testului

  1. investigarea unui eveniment tromboembolic inexplicabil la tinerii cu antecedente familiale de astfel de evenimente
  2. investigarea unor episoade de tromboza venoasa cu localizari atipice
  3. diagnosticul deficientelor congenitale sau dobandite (tratament cu heparina, afectiuni hepatice grave, sindrom nefrotic, administrare de contraceptive orale, coagulare intravasculara diseminata, preeclampsie)

Valorile normale: 80-120%

Variatii fiziologice Valorile AT variaza in functie de varsta, sex si status hormonal.
La nou nascut, nivelul AT este scazut pana la 6 luni. Pe parcursul sarcinii, nivelul scade dupa a 13 a saptamana de gestatie si postpartum.
Femeile la menopauza prezinta valori ale AT mai mici decat la barbati.

Variatii patologice Niveluri de 40-60% se intalnesc frecvent in deficienta congenitala.

 

Proteina C
Proteina C este o glicoproteina dependenta de vitamina K cu rol in prevenirea trombozelor. Rolul său de anticoagulant se exercita prin inactivarea factorilor V si VIII; procesul necesita prezenta proteinei S, a ionilor de calciu si o suprafata membranara fosfolipidica.

Metode de determinare
Pentru determinarea proteinei C se utilizeaza atat metode coagulometrice, cat si cromogenice.
In diagnosticul deficientelor proteinei C, in special deficienta de tip II, metoda coagulometrica trebuie sa constituie prima alegere, datorita eliminarii unor interferente importante, cum ar fi: deficienta de factori ai coagularii si proteina S.
Metoda cromogenica (test de activitate) presupune parcurgerea a doua etape:

  1. In prima etapa, proteina C este activata de un extract de venin de sarpe (Agkistrodom contortrix)

Proteina C + venin de sarpe Proteina C activata

  1. Activitatea enzimei este masurata cu ajutorul unui cromogen specific. Extinctia compusului astfel obtinut masurata la 405 nm este direct proportionala cu cantitatea de enzima.

 

Valoarea clinica a testului

  1. investigarea unui eveniment tromboembolic inexplicabil la tinerii cu antecedente familiale de astfel de evenimente
  2. investigarea unor episoade de tromboza venoasa cu localizari atipice
  3. diagnosticul deficientei mostenite sau dobandite (tratament cu anticoagulante orale, afectiuni hepatice, sindrom nefrotic, coagulare intravasculara diseminata)

Valori normale: 70-130%

Variatii fiziologice Proteina C prezinta valori scazute la nastere. Cresteri usoare se remarca in sarcina si postpartum.
Variatii patologice: 25-7% pentru heterozigotii cu deficienta de proteina C activata

Proteina S
Proteina S este o glicoproteina dependenta de vitamina K. In organism, se gaseste sub doua forme: proteina S libera (40%) cu rol de cofactor al proteinei C activate si legata de proteina de legare a fractiunii C4b a complementului (C4b binding protein).
Proteina S potenteaza inactivarea factorului Va si VIIa la nivelul suprafetei fosfolipidice.

Metode de determinare
In uzul curent, se folosesc mai multe teste pentru determinarea proteinei S:

  1. teste de activitate efectuate prin metode coagulometrice
  2. determinarea antigenului proteina S libera prin tehnici ELISA si imunotrurbidimetrice cu detectie fotometrica
  3. determinarea antigenului total prin tehnici ELISA

Metode de determinare
Unele laboratoare utilizeaza tehnicile imunoturbidimetrice cu detectie fotometica in sistem complet automatizat ca prima intentie in diagnosticul deficientei de PS datorita avantajelor incontestabile ale acestei metode: rapiditate, stabilitate, utilizarea reactivilor precalibrat si sistem de control multiparametric. Cu toate acestea, unii pacienti cu defect calitativ sau aflati sub tratament cu warfarina pot scapa diagnosticului. Din acest motiv, sunt necesare si unele teste complementare.

Valoarea clinica a testului

  1. investigarea unui eveniment tromboembolic inexplicabil la tinerii cu antecedente familiale de astfel de evenimente
  2. investigarea unor episoade de tromboza venoasa cu localizari atipice
  3. deficienta congenitala sau dobandita de proteina S (tratament cu warfarina, contraceptive orale, boli hepatice, sindrom nefrotic, sindrom inflamator)

Valori normale: <65%

Variatii fiziologice
Valorile PS variaza in functie de sex, femeile prezentand valori ale free si total PS mai scazute decat barbatii.
La nastere, PS totala este scazuta, in timp ce free PS este normal.
In sarcina, valorile PS sunt scazute.

Variatii patologice: deficiente de proteina S

 

Rezistenta la proteina C activata
Rezistenta la proteina C activata desemneaza lipsa raspunsului anticoagulant al proteinei C activate (APC) si predispozitia crescuta la tromboze venoase.
Rezistenta la proteina C activata este determinata de o mutatie genetica prin care se obtine un factor V anormal (denumit factor V Leiden) caracterizat prin substitutia Arg 506 cu Gln. In mod normal, factorul V este inactivat prin clivajul lantului greu in 3 situsuri: Arg 506, Arg 306, Arg 679. Initial, are loc clivajul la Arg 506, cu etalarea situsurilor Arg 306 si Arg 679.
In absenta Arg 506, factorul V Leiden este inactivat prin clivajul la nivelul Arg 306,viteza de inactivare fiind de 10 ori mai mica decat la factorul V normal, situatie care conduce la rezistenta la proteina C activata.

Metode de determinare
Testele utilizate in prezent evalueaza capacitatea de inactivare a factorului V din proba de analizat de catre proteina C activata. Ele se bazeaza pe metode coagulometrice ce actioneaza la nivelul complexului protrombinazic prin utilizarea unui activator specific de protrombina dependent de factorul V. Pentru unele metode, este nevoie de 2 determinari/pacient, repectiv cu si fara adaugare de APC, rezultatul fiind exprimat ca raport intre cei 2 timpi de coagulare.
Tehnicile moderne utilizeaza activatori specifici ai factorului X (veninul de Crotalus viridis helleri) in prezenta plasmei deficiente in factorul V, a ionilor de Ca si a APC, astfel incat este suficienta efectuarea unui singur test /pacient.
Rezultatul se exprima in secunde, valori de 120 s fiind considerate cut-off. Un timp de coagulare <120s este echivalent cu rezistenta la APC.

 

Anticoagulantii lupici
Anticoagulantii lupici (LA) constituie un grup heterogen de anticorpi indreptati impotriva complexelor fosfolipide (cardiolipina, fosfatidil serina, fosfatidilinozitol) – proteine (protrombina, β2 glicoproteina 1) Prezenta lor este asociata cu rsc crescut de tromboza, avort spontan, trombocitopenie.
Heterogenitatea anticorpilor lupici face diagnosticul prezentei lor dificil. Un singur test nu este suficient pentri diagnosticul de certitudine.
Algoritmul de testare a prezentei LA cuprinde trei etape:

  1. Screening-ul consta in efectuarea a 2 teste bazate pe principii diferite (dRWT = testul cu venin de vipera Russel diluat) si un test APTT folosind reactiv specific (PTT-LA) ce contine ca activator silica si un continut scazut de fosfolipide. Testul dRWT prezinta sensibilitatea cea mai mare, urmat fiind de PTT-LA. Obtinerea unui rezultat anormal la unul dintre cele 2 teste impune trecerea la urmatoarele etape.
  2. Mixing studies in care se utilizeaza un amestec de plasma normala si plasma de pacient (1:1) fara preincubare cu care se repeta testul PTT-LA. Prezenta unui inhibitor este demonstrata cand timpul de coagulare ramane prelungit dupa adaugarea plasmei normale. O valoare APTT normala indica o corectie a timpului de coagulare obtinuta prin adaugarea plasmei normale. In acest caz, este vorba de o deficienta in factori de coagulare (corectat de aportul lor din plasma normala) si nu de prezenta LA. Daca APTT continua sa fie prelungit, inseamna ca adosul de plasma normala nu a facut altceva decat sa dilueze LA si se trece la a treia etapa , cea de confirmare.
  3. Testele de confirmare se efectueaza cu un reactiv cu continut mare de fosfolipide (in dublu strat sau in faza hexagonala). Rezultatul obtinut la testele de confirmare se compara cu cel obtinut la testele screening, urmat de calculul raportului Normalized ratio, dupa formula:

Normalized ratio = Screen ratio/Confirm ratio
Valori ≥ 1.2 confirma prezenta LA.

Reactivii folositi pentru confirmare si screening trebuie sa prezinte un grad de specificitate mare si sa inlature interferenta factorilor coagularii, a inhibitorilor, precum si a heparinei. Reactivii STAGO STA Staclot DRVVScreen si Confirm sunt singurii ce raspund acestor cerinte. In cazul utilizarii altor reactivi, se recomanda efectuarea simultana a unui timp de trombina care sa inlature aceste interferente.

 

Anticorpii antifosfolipidici
Anticorpii antifosfolipidici (APA) apartin aceleiasi clase ca LA, ):1776-83.fiind anticorpi indreptati impotriva fosfolipidelor membranare. Prezenta lor este asociata cu tromboza venoasa si arteriala, avort spontan, nastere prematura sau preeclampsie. Cei mai frecventi APA sunt anticorpii anticardiolipinici si anti β2 glicoproteina1.
Pentru determinarea lor se folosesc tehnici ELISA .

 

Bibliografie
1. Agrawal N et a.l-Activated protein C resistance in deep venous thrombosis. Ann Vasc Surg 2009;23(3):364-6.
2. Dati F, Metzmann E- Proteins-Laboratory testing and clinical use- Dia Sys Diagnostic System GmbH, 2005.
3. Finnegan K, Cutsforth G-Hemostasis test compatibility with capped and uncapped tubes. Clin Lab Sci 2011Fall; 24(4):215-20.
4. Legani C et al.- Different cut-off values of quantitative D-dimer methods to predict the risk of venous thromboembolism reccurence: a post-hoc analysis of the PROLONG study. Haematologica 2008; 93(6): 900-7.
5. Park KJ et al.- Significantly different coagulation factor activities underlying the variability of normal activated partial thromboplastin time. Blood Coagul Fibrinolysis 2012;23(1):35-8.
6. Pengo A- Update of the guidelines for lupus anticoagulant detection. Subcommittee on Lupus Anticoagulant/Antiphospholipid Antibody of the Scientific and Standardisation Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. J Thromb Haemost, 2009,7:1737-40.
7. Swadzba J et al.- Lupus anticoagulant performance of the tests as recommended by the latest ISTH guidelines. J Thromb Haemost 2011;9(9):1776-83.
8. Tripodi A.- To mix or not to mix in lupus anticoagulant testing? That is the question. Semin Thromb Hemost 2012;38(4):385-9.
9. Verhovsek M et al.- Systematic review: D-dimer to predict recurrent disease after stopping anticoagulant therapy for unprovoken venous thromboembolism. Ann Intern Med 2008;149(7):481-90.